Теломераза – не лекарство от старости, а фермент, решающий "проблему концевой репликации ДНК".

В начале 60-х годов американский учёный Леонард Хейфлик обнаружил, что при культивировании в питательной среде вне организма in vitro нормальные диплоидные (соматические) клетки человека способны делиться лишь ограниченное число раз. Предельное число делений зависело от возраста того, кому принадлежали клетки, взятые в культуру. Так, клетки от новорождённых детей могли пройти 80-90 делений, в то время, как клетки от 70-летних стариков делились только 20-30 раз. Максимальное число клеточных делений было названо "лимитом Хейфлика".

В 1971 году отечественный учёный А.М. Оловников в своей "теории маргинотомии" (от латин. marginalis - краевой, tome - сечение) предположил, что в основе ограниченного потенциала удвоения нормальных соматических клеток, растущих в культуре in vitro, может лежать постепенное укорочение ДНК хромосом с каждым раундом репликации.

Известно, что хромосомы соматических клеток человека несут на каждом конце многократно повторённые гексамеры - TTAGGG, общая длина которых может достигать 10 тысяч пар нуклеотидов. В комплексе со специфическими белками такие тандемные повторы образуют концевые районы хромосом- теломеры. Эти специализированные структуры защищают кодирующую часть ДНК от действия экзонуклеаз, предотвращают неправильную рекомбинацию хромосом и позволяют им прикрепляться к ядерной оболочке. Известно также, что в ходе культивирования in vitro некоторых клонов нормальных клеток (например, фибробластов человека) происходит укорочение теломер в среднем на 50 пар нуклеотидов за каждый цикл деления. Подобное укорочение хромосом происходит in vivo в подавляющем большинстве дифференцированных клеток человека.

Потеря концевых последовательностей при репликации ДНК является одной из причин старения и гибели большинства соматических клеток. Тот же А.М. Оловников предположил, что в клетках организмов, размножающихся вегетативным путём, а также в эмбриональных, стволовых, половых и неограниченно долго делящихся в культуре раковых клетках, "проблема концевой репликации" разрешается за счет существования особого биологического механизма. Эта гипотеза подтвердилась с открытием в 1985 г. теломеразы- фермента, способного наращивать концы линейных молекул ДНК-носителей генетической информации.

Преемственность генетического материала в поколениях клеток и организмов обеспечивается процессом репликации - удвоения молекул ДНК. В результате этого сложного процесса, осуществляемого комплексом нескольких ферментов и белков, не обладающих каталитической активностью, но необходимых для придания полинуклеотидным цепям нужной конформации, образуются две идентичные двойные спирали ДНК. Эти так называемые "дочерние" молекулы ничем не отличаются друг от друга и от исходной "материнской" молекулы ДНК. Репликация происходит в клетке перед ее делением, поэтому каждая дочерняя клетка получает точно такие же молекулы ДНК, какие имела материнская клетка.

"Проблема концевой репликации" заключается в том, что все известные ДНК-полимеразы, являющиеся ключевыми ферментами сложного репликативного белкового комплекса, неспособны полностью реплицировать концы линейных молекул ДНК. Для того, чтобы клетки не теряли при делении часть генетического материала, 3'-концы ДНК хромосом эукариот наращиваются перед каждым раундом репликации короткими повторяющимися последовательностями. В этом и состоит функция теломеразы.

Активность теломеразы у высших эукариот обнаружена лишь в следующих типах клеток: зародышевых, половых, стволовых и раковых, а также в линиях иммортализованных ("бессмертных") клеточных культур in vitro. В организме при дифференцировке клеток теломераза репрессируется.

Для того, чтобы понять, каким образом теломераза решает "проблему концевой репликации", необходимо рассмотреть принципы репликации, порождающие эту проблему.

 

Принципы репликации

Процесс репликации ДНК основан на следующих принципах:

Комплементарность.

Каждая из двух цепей "материнской" молекулы ДНК служит матрицей для синтеза дополняющей её, т.е. комплементарной "дочерней" цепи (рис.1).

dimshits1.gif (17519 bytes)

Рис.1 Образование полуконсервативных "дочерних" молекул ДНК в результате репликации. Синтез "дочерних" цепей идёт в направлении от 5' к 3' комплементарно и антипараллельно цепям "материнской" молекулы.

Полуконсервативность.

В результате репликации образуются две двойные "дочерние" спирали, каждая из которых сохраняет (консервирует) в неизменном виде одну из половин "материнской" ДНК. Вторые цепи "дочерних" молекул синтезируются из дезоксирибонуклеотидов заново по принципу комплементарности к нитям "материнской" ДНК. "Дочерние" ДНК ничем не отличаются друг от друга и от "материнской" двойной спирали (рис.1).

 

Антипараллельность и униполярность.

Каждая цепь ДНК имеет определённую ориентацию. Один конец несёт гидроксильную группу (ОН), присоединённую к 3'-углероду в сахаре дезоксирибозе, на другом конце цепи находится остаток фосфорной кислоты в 5'-положении сахара. Две комплементарные цепи в молекуле ДНК ориентированы в противоположных направлениях - антипараллельно (рис.1) (при параллельной ориентации напротив 3'-конца одной цепи находился бы 3'-конец другой). ДНК-полимеразы - ферменты, синтезирующие новые нити ДНК, могут передвигаться вдоль матричных цепей лишь в одном направлении - от их 3'-концов к 5'-концам. При этом синтез комплементарных нитей всегда ведётся в 3' направлении, то есть униполярно. Поэтому в процессе репликации одновременный синтез новых цепей идёт антипараллельно (рис.1).

 

Прерывистость.

Для того, чтобы новые нити ДНК были построены по принципу комплементарности, двойная спираль должна быть раскручена и между родительскими цепями должны отсутствовать водородные связи. Только в этом случае ДНК-полимеразы способны двигаться по "материнским" нитям и использовать их в качестве матрицы для безошибочного синтеза "дочерних" цепей. Но полное раскручивание спиралей, состоящих из многих миллионов пар нуклеотидов, сопряжено со столь значительным количеством вращений и такими энергетическими затратами, которые невозможны в условиях клетки. Поэтому репликация начинается одновременно в нескольких местах молекулы ДНК. Участок между двумя точками, в которых начинается синтез "дочерних" цепей, называется репликоном (рис.2). В эукариотической клетке в каждой молекуле ДНК имеются в зависимости от размеров сотни и даже тысячи репликонов.

dimshits2.gif (5945 bytes)

Рис.2 Репликация ДНК эукариотической хромосомы. Показан один из многих репликонов. Репликативные вилки движутся в противоположных направлениях от точки начала репликации.

В каждом репликоне можно видеть "репликативную вилку" - ту часть молекулы ДНК, которая под действием специальных ферментов уже расплелась (рис.2 и рис.3). Каждая нить в вилке служит матрицей для синтеза комплементарной "дочерней" цепи. В ходе репликации вилка перемещается вдоль "материнской" молекулы, при этом расплетаются новые участки ДНК. Так как ДНК-полимеразы могут двигаться лишь в одном направлении вдоль матричных нитей, а нити ориентированы антипараллельно, то в каждой вилке одновременно ведут синтез два по разному организованных репликативных ферментативных комплекса. Одна "дочерняя" цепь (лидирующая) растёт непрерывно, а другая (отстающая) - в виде фрагментов длиной в несколько сотен нуклеотидов (рис.3). Такие фрагменты, названные в честь открывшего их японского учёного "фрагментами Оказаки", сшиваются в непрерывную нить ДНК-лигазой, входящей в ферментативный комплекс. Механизм синтеза "дочерних" цепей ДНК фрагментами называют прерывистым.

dimshits3.gif (5842 bytes)

Рис.3 Схема образования "дочерних" цепей ДНК в репликативной вилке. Лидирующая цепь синтезируется непрерывно; отстающая цепь сшивается из фрагментов Оказаки после удаления РНК-затравок и заделывания брешей.

 

Потребность в затравке.

ДНК-полимераза не способна начать синтез ни лидирующей цепи, ни фрагментов Оказаки отстающей цепи. Она может лишь наращивать уже имеющуюся полинуклеотидную нить, последовательно присоединяя дезоксирибонуклеотиды к её 3'-ОН концу. Откуда же берётся начальный 5'-концевой участок растущей цепи? Его синтезирует особая РНК-полимераза, называемая праймазой (от англ. primer - затравка). Размер рибонуклеотидной затравки невелик (< 20 нуклеотидов) в сравнении с размером цепи ДНК, образуемой ДНК-полимеразой. Выполнившая свою функцию РНК-затравка удаляется специальным ферментом, а образованная при этом брешь заделывается ДНК-полимеразой, использующей в качестве затравки 3'-ОН конец рядом стоящего фрагмента Оказаки (рис 3).

Удаление крайних РНК-затравок, комплементарных 3'-концам обеих цепей линейной "материнской" молекулы ДНК, приводит к тому, что "дочерние" цепи оказываются короче на 10-20 нуклеотидов ( у разных видов размер РНК-затравок различен). В этом и заключается проблема репликации концов линейных молекул. В случае удвоения кольцевых бактериальных ДНК этой проблемы не существует, т.к. первые по времени образования РНК-затравки удаляются ферментом, который одновременно заполняет образующуюся брешь путём наращивания 3'-ОН конца растущей цепи ДНК, направленной в "хвост" удаляемому праймеру.

В эукариотических клетках проблема недорепликации 3'-концов линейных молекул ДНК решается с помощью теломеразы (см. "Биохимия". 1997. Т.62. N11).

Как работает теломераза.

Что же представляет из себя этот фермент? В 1985 году он был обнаружен у равноресничной инфузории Tetrahymena thermophila, а впоследствии - в дрожжах, растениях и животных, в том числе в яичниках человека и иммортализованных линиях раковых клеток HeLa. Теломераза является ДНК-полимеразой, достраивающей 3'-концы линейных молекул ДНК хромосом короткими (6-8 нуклеотидов) повторяющимися последовательностями (у позвоночных TTAGGG). Помимо белковых субъединиц теломераза содержит РНК, выполняющую роль матрицы для наращивания ДНК повторами. Длина теломеразной РНК колеблется от 150 нуклеотидов у простейших до 1400 нуклеотидов у дрожжей; у человека - 450 нуклеотидов. Сам факт наличия в РНК последовательности, по которой идёт матричный синтез куска ДНК, позволяет отнести теломеразу к своеобразной обратной транскриптазе, т.е. ферменту, способному вести синтез ДНК по матрице РНК.

В результате того, что после каждой репликации "дочерние" цепи ДНК оказываются короче "материнских" на размер первого РНК-праймера, образуются выступающие однонитевые 3'-концы "материнских" цепей. Они-то и узнаются теломеразой, которая последовательно наращивает "материнские" цепи (у человека на сотни повторов), используя 3'-ОН концы их в качестве затравок, а РНК, входящую в состав фермента, в качестве матрицы. Образующиеся длинные одноцепочечные концы, в свою очередь, служат матрицами для синтеза дочерних цепей по традиционному репликативному механизму (рис.4).

dimshits4.gif (4734 bytes)

Рис.4 Наращивание концов ДНК хромосом эукариот теломерными повторами. Изображён один из концов хромосомы; другой удлиняется по такой же схеме.

Схема удлинения концов линейных молекул ДНК представлена на рис.5. Сначала происходит комплементарное связывание выступающего конца ДНК с матричным участком теломеразной РНК, затем теломераза наращивает ДНК, используя в качестве затравки её 3'-ОН конец, а в качестве матрицы - РНК, входящую в состав фермента. Эта стадия называется элонгацией. После этого происходит транслокация, т.е. перемещение ДНК, удлинённой на один повтор, относительно фермента. Следом идёт элонгация и очередная транслокация. В результате образуются теломеры, содержащие многократно повторённые короткие последовательности. Поскольку эти последовательности нуклеотидов не являются кодирующими, то они выступают в роли буферной зоны как защита от "проблемы концевой репликации". Укорочение ДНК в ходе каждого раунда репликации лишь сокращает нетранскрибируемый текст теломеры, но не приводит к утрате смысловых последовательностей - генов и регуляторов их экспрессии.

Таким образом совместное действие ферментов репликации и теломеразы обеспечивает преемственность генетического материала в поколениях клеток и организмов.

dimshits5.gif (16002 bytes)

Рис.5 Схема удлинения 3'-конца ДНК с помощью РНК-содержащегофермента - теломеразы. Красным цветом выделены спаренные комплементарные нуклеотиды выступающего конца ДНК и матричного участка теломеразной РНК.

 

Теломераза и "клеточное бессмертие"

В дифференцированных соматических клетках, как in vivo, так и культивируемых in vitro (например, в фибробластах человека), теломераза не работает и теломеры постоянно укорачиваются. Длина теломер достоверно коррелирует с пролиферативным потенциалом. Укорочение теломер может играть роль митотических часов, отсчитывающих число делений клетки. По достижении критической длины теломерной ДНК запускаются процессы остановки клеточного цикла.

Опубликованная в 1998 г. в журнале "Science" статья американских исследователей благодаря средствам массовой информации привлекла внимание не только учёных (а в первую очередь не учёных) в связи с проблемами старения и "клеточного бессмертия". В этой прекрасной работе коллектива, возглавляемого Джерри Шеем, удалось на 40% увеличить число делений нормальных соматических клеток человека в культуре. С помощью генноинженерных методов в клетки был введён ген каталитической белковой субъединицы теломеразы и прилегающий к нему участок ДНК, регулирующий его работу. При активной работе гена - его экспрессии, увеличивался как размер теломерной ДНК, так и продолжительность жизни клеточных культур.

Укорочение теломер можно рассматривать как молекулярный индикатор количества делений клетки, но не старения организма в целом. Так, при культивировании нормальных фибробластов человека, взятых от доноров в возрасте от 0 до 93 лет, выявили корреляцию между начальной длиной теломер и пролиферативной способностью клетки во всём диапазоне возрастов. А размер теломерной ДНК сперматозоидов не уменьшался с увеличением возраста мужчины, что говорит об экспрессии теломеразы в линии половых клеток.

Прекращение работы теломеразы, отмечаемое в подавляющем большинстве дифференцированных соматических клеток животных, является, по-видимому, одним из необходимых условий на пути достижения биологической целесообразности. Старение особи - это нормальная биологическая функция, способствующая прогрессивной эволюции вида, размножающегося половым путём. Давление естественного отбора ослабевает после достижения организмом репродуктивного успеха, поскольку существование особи после этого имеет меньшее значение для вида. Смерть от старости удаляет из популяции выполнивших свою роль предков и даёт простор потомкам - носителям новых полезных признаков. Как любая важная биологическая функция, старение обусловлено параллельным действием нескольких молекулярных механизмов. Выключение теломеразы - лишь один из них.

Не стоит рассматривать гены, кодирующие белковые субъединицы теломеразы и входящую в её состав РНК, как "гены бессмертия". Поддержание длины теломерной ДНК на определённом уровне зависит не только от взаимодействия с ней теломеразы и теломерсвязывающих белков, но и других, пока неизвестных факторов, регулирующих образование самих компонентов теломер-образующего комплекса.

Вряд ли бессмертие, достигнутое раковыми клетками, размножающимися в культуре in vitro десятилетиями без укорочения теломер - это то, к чему нужно стремиться. Лекарства от смерти нет! Но тот факт, что введение в раковые клетки HeLa препаратов, блокирующих РНК-компонент теломеразы, приводит к укорочению теломер и последующей гибели клеток, вселяет надежду на появление новых средств борьбы с раком.

Понимание механизма работы теломеразы, а, главное, регуляции её экспрессии в клетке, приблизит нас к пониманию процессов и злокачественной трансформации, и старения.

Автор благодарен аспиранту М.К. Иванову, создавшему иллюстрации к статье.

Г.М. Дымшиц, доктор биологических наук,

Институт цитологии и генетики СО РАН,

Новосибирск (630090, Новосибирск, пр. Лаврентьева, 10).

mailto:dimshits@%20bionet.nsc.ru

Hosted by uCoz